POP 26 · Procedimento Operacional Padrão
Ensaio de MTT
Guia rápido de bancada baseado no POP 26 do BioTecFarm. Três dias de experimento, com os materiais a autoclavar, a metodologia detalhada e as calculadoras de plaqueamento e de tratamento.
Fluxo do ensaio
→
→
Ferramentas
Calculadora de Neubauer
Contagem celular e cálculo dos volumes para o plaqueamento.
Planejamento da placa
Visualização da placa de 96 poços.
Tudo autoclavado — plaqueamento liberado
Autoclavar antes
Dia 1 — Plaqueamento celular
Materiais que precisam sair da autoclave prontos para este dia. Autoclave na véspera, para que estejam secos e frios na hora do experimento.
0% pronto
Separar e conferir — não vai na autoclave
Separar e conferir — não vai na autoclave
Metodologia passo a passo — Plaqueamento
Metodologia passo a passo — Plaqueamento
-
Como tripsinizar
- 1Na garrafa de cultura, adicionar 3 mL de tripsina
- 2Levar à incubadora por 3 a 5 minutos
- 3Verificar no microscópio se as células desaderiram — caso não, dar leves batidas na garrafa e verificar novamente
- 4Levar de volta ao fluxo e adicionar 3 mL de meio para cortar a ação da tripsina
-
Preparo, preenchimento e contagem
- 1Lavar a câmara de Neubauer e a lamínula com água destilada, secar bem e posicionar a lamínula na área de contagem
- 2Misturar o conteúdo do eppendorf e retirar uma alíquota de 10 µL
- 3Encostar a ponteira na borda da lamínula e deixar preencher por capilaridade — evitar bolhas e transbordamento para os canais laterais
- 4Focalizar a área demarcada com a objetiva de menor aumento
- 5Contar os quadrantes da esquerda para a direita e, ao fim da linha, descer e voltar no sentido contrário — em zigue-zague, como na imagem:
Sentido da contagem em zigue-zague- 6Regra de borda: contar as células que tocam as bordas superior e esquerda; não contar as que tocam as bordas inferior e direita — assim células entre dois quadrantes são contadas uma única vez:
Verde: células contadas · Vermelho: células não contadas -
Identificação e mistura na barquinha
- 1Identificar as placas com as concentrações, linhagem, data e nome do responsável
- 2Adicionar na barquinha autoclavada os volumes de células e de meio obtidos na calculadora
- 3Homogeneizar cuidadosamente, sem formar bolhas
Plaqueamento — 100 µL por poço
- 1Com a multicanal, pegar 100 µL da mistura da barquinha — esses 100 µL são o volume final por poço usado no cálculo: a soma do volume de células + volume de meio que cabe a cada poço
- 2Adicionar aos poços identificados, sem encostar a ponteira no fundo
- 3Plaquear no sentido oposto ao que será usado no tratamento, para cada poço da triplicata receber uma pipetagem diferente
Se o tratamento vai ocupar as linhas (horizontal), as células devem ser plaqueadas no sentido oposto — pelas colunas. Fonte: POP 26.
Tudo autoclavado — tratamento liberado
Autoclavar antes
Dia 2 — Tratamento celular
Materiais que precisam sair da autoclave prontos para este dia. Autoclave na véspera, para que estejam secos e frios na hora do experimento.
0% pronto
Separar e conferir — não vai na autoclave
Separar e conferir — não vai na autoclave
Metodologia passo a passo — Tratamento
Metodologia passo a passo — Tratamento
-
Como calcular
Você define- 1A concentração da solução estoque (C1)
- 2A maior concentração a testar no poço (C2) — será o primeiro ponto da curva
- 3Quantos pontos (concentrações). Vale a equivalência 1 ponto → 1 triplicata: cada ponto ocupa 3 poços exclusivos daquela concentração
- 4Quais controles entram — o controle sem tratamento (meio + células) e os variados que o projeto pedir (veículo/solvente, positivo, branco). Cada controle também ocupa a sua própria triplicata
Você calcula- 5Volume por ponto = poços da triplicata × volume por poço — como 1 ponto → 1 triplicata, cada ponto precisa render os seus 3 poços
- 6Volume do primeiro ponto = o dobro do volume por ponto — metade dele será transferida ao ponto seguinte
- 7Volume de estoque, por C1 × V1 = C2 × V2, sendo V2 o volume do primeiro ponto
- 8Volume de meio = volume do primeiro ponto − volume de estoque
- 9Solvente no poço = volume de estoque ÷ volume do primeiro ponto — deve ficar abaixo de 1%
A Calculadora de tratamento devolve esses volumes prontos a partir dos seus dados. -
Passo a passo da seriada
- 1Primeiro ponto: preparar o dobro do volume — meio + amostra, nos volumes obtidos no cálculo
- 2Demais pontos: colocar previamente apenas meio puro, na metade do volume do primeiro ponto
- 3Homogeneizar o primeiro ponto e transferir metade dele ao ponto seguinte — ao cair num volume igual de meio, a concentração cai pela metade, gerando o ponto (e a triplicata) seguinte
- 4Homogeneizar e repetir a transferência sucessivamente até o último ponto
- 5No último ponto, descartar o volume excedente — assim todos terminam com o mesmo volume
1 ponto → 1 triplicata: cada ponto da diluição ocupa 3 poços exclusivos (uma linha da placa) e a diluição desce de linha em linha, no sentido oposto ao usado no plaqueamento das células. Os controles seguem a mesma regra, em linhas próprias: o controle sem tratamento leva apenas meio + células, e os controles variados (veículo, positivo, branco) ocupam suas próprias triplicatas. -
Aplicação na placa
- 1Com a pipeta de 200 µL, adicionar 100 µL de tratamento por poço, conforme a concentração desenhada na placa
- 2Respeitar 1 ponto → 1 triplicata: cada ponto vai nos seus 3 poços exclusivos, nunca no trio de outro ponto
- 3Repetir para todas as concentrações e incluir os controles, também em triplicata: o controle sem tratamento (meio + células) e os controles variados que o projeto pedir — veículo/solvente, controle positivo, branco
Tudo autoclavado — adição de MTT liberada
Autoclavar antes
Dia 3 — Adição de MTT
Materiais que precisam sair da autoclave prontos para este dia. Autoclave na véspera, para que estejam secos e frios na hora do experimento.
0% pronto
Separar e conferir — não vai na autoclave
Separar e conferir — não vai na autoclave
Metodologia passo a passo — Adição de MTT
Metodologia passo a passo — Adição de MTT
Planejamento experimental
Placa de 96 poços
Abrir calculadorasSelecione um grupo abaixo e clique — ou arraste — sobre os poços para montar o mapa da placa. Os nomes dos grupos são editáveis: escreva a identificação ou a concentração que usará no seu experimento. A letra ou número dentro do poço indica o tipo de grupo selecionado, para que o mapa continue legível quando impresso.
Controles
0
0
Tratamentos
0
0
0
Ajustes
0
0
96 poços livres
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
O mapa fica salvo neste navegador e pode ser retomado ao reabrir o protocolo.
Câmara de Neubauer
Calculadora de plaqueamento
Abrir placaDigite quantas células você contou em cada quadrante. Se contou menos de 4, deixe os outros em branco — a média se ajusta automaticamente.
10 = padrão do POP (10 µL de células + 90 µL de azul de tripan)
× 10^
= 10.000 células por poço
ISO 10993-5 recomenda 1 × 10⁴ · o exemplo do POP usa 5 × 10³
Sempre com margem de erro: para 1 placa de 96, use 100
100 µL = padrão para placa de 96 poços
Preencha a contagem dos quadrantes acima
para ver os cálculos passo a passo
para ver os cálculos passo a passo
Diluição seriada
Concentração da sua solução estoque
Concentração do primeiro ponto (a mais alta da curva)
Calculadora de tratamento
Preencha os dados do seu tratamento. As contas seguem o POP: primeiro ponto com o dobro (metade é transferida), C1 × V1 = C2 × V2 e fator de diluição 2 entre os pontos.
Cada ponto tem metade da concentração do anterior
Triplicata = 3 poços
100 µL = padrão para placa de 96 poços
Se sim, a calculadora confere a regra do solvente abaixo de 1% no poço
Preencha o estoque e a maior concentração
para ver os volumes da diluição seriada
para ver os volumes da diluição seriada